Demuestran NIPT para células fetales mediante PCR digital por gotitas

La mayoría de las pruebas de diagnóstico prenatales no invasivas (NIPT) en el ADN analizan hoy el ADN fetal libre de células, que se mezcla con grandes cantidades de ADN libre de células maternas en la sangre de la madre. Sin embargo, desde hace tiempo se sabe que una cantidad muy pequeña de células fetales o placentarias, estimadas en menos de 10/mL, circulan en la sangre de las mujeres embarazadas.

Los científicos del Instituto Nacional de Investigación para la Salud y el Desarrollo Infantil (Tokio, Japón) reclutaron a 32 mujeres embarazadas sin complicaciones obstétricas o anormalidades y malformaciones según lo determinado por la ecografía fetal a las 20 semanas de gestación. Se obtuvo sangre periférica de cada mujer embarazada y se extrajeron las células no nucleadas.

Las células sanguíneas nucleadas lavadas se mezclaron con 10 μl de microperlas CD45 y microperlas CD14 (Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Se recogió la fracción de células CD45–CD14–, se eliminaron los glóbulos blancos y las células grandes para alinear el tamaño de las células, y las células se lavaron dos veces. Las células organizadas mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) se resuspendieron, procesaron y las células coloreadas se observaron usando el sistema de microscopio de fluorescencia Axio Imager 2 (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Alemania).

Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa digital en gotitas de una sola célula (sc-ddPCR) y después de usar el Generador de Gotitas QX200, la PCR se analizó posteriormente con la señal de cada gotita usando el Lector de Gotitas QX200 (Bio-Rad, Hércules, CA, Estados Unidos). Se extrajo el ADN de cada una de las suspensiones celulares o muestras de sangre del cordón umbilical. El equipo realizó la confirmación genética de las células fetales masculinas circulantes en la fracción de células CD45–CD14–. El equipo utilizó una sonda de referencia, RPP30, y una sonda específica de cromosoma Y para el gen SRY. Una ventaja de usar ese sistema es que puede analizar hasta 3.000 células individuales por pozo.

La modificación hecha por el equipo del sistema sc-ddPCR permitió la evaluación de células fetales circulantes raras en las muestras de sangre periférica de mujeres embarazadas que llevan fetos masculinos. Sin embargo, se esperaba la observación de más gotas de RPP30+SRY+ en cada muestra porque había un contenido de dos a seis células fetales circulantes en 1 mL de sangre materna. Cuando aplicaron su prueba a las fracciones celulares de 13 muestras de sangre periférica materna, descubrieron que solo llamaba correctamente las tres muestras de mujeres con un feto masculino como positivas para SRY y las 10 muestras de mujeres con un feto femenino como negativas para SRY.

Los autores concluyeron que habían demostrado que el sistema sc-ddPCR modificado era capaz de evaluar efectivamente el ADN genómico de cada célula objetivo en una muestra biológica clasificada de forma cruda. Este sistema no tiene precedentes, en que se puede analizar el ADN de numerosas células vivas individuales simplemente con alta sensibilidad y especificidad sin necesidad de pasos de amplificación de todo el genoma, fijación celular o coloración celular. Además, este estudio sirve como prueba de concepto para el diagnóstico definitivo prenatal no invasivo con células fetales circulantes extremadamente raras utilizando nuestro sistema sc-ddPCR modificado. El estudio fue publicado en la edición de febrero de 2020 de la revista Journal of Molecular Diagnostics.

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Instituto Nacional de Investigación para la Salud y el Desarrollo Infantil
Miltenyi Biotech GmbH
Carl Zeiss Microscopy
Bio-Rad