Desarrollan análisis para determinar ocupación de la BTK homogénea

La BTK promueve el desarrollo y la maduración de las células B a través de la activación de los reguladores del ciclo celular y los factores de diferenciación, y dirige la proliferación de las células B y la supervivencia a través de la regulación de la apoptosis. Con su papel central en la señalización y supervivencia del receptor de células B (BCR), la BTK es un promotor oncogénico en la leucemia linfocítica crónica (LLC) humana y el subtipo de linfocitos B grandes difusos activados tipo B (ABC-DLBCL).

Científicos de Gilead Sciences, Inc. (Foster City, CA, EUA) desarrollaron un ensayo nuevo de ocupación de BTK homogéneo dúplex basado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia con resolución temporal (TR-FRET) para medir los niveles de BTK libres y totales en un formato multiplexado. El ensayo puede medir la participación de los objetivos en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y en muestras de ganglios linfáticos y médula ósea. El ensayo proporciona una evaluación exacta y cuantitativa de la ocupación de BTK y actualmente está en uso en estudios clínicos en curso usando el tirabrutinib.

El ensayo aprovecha la emisión de doble longitud de onda del anticuerpo anti-BTK conjugado con terbio para servir como el donante de energía para dos aceptores de energía fluorescente con espectros de excitación y emisión distintos: uno, tirabrutinib biotinilado unido a estreptavidina G2 y que puede detectar la BTK libre y un segundo anticuerpo anti-BTK acoplado a D2 que se une a un epítope de BTK diferente y que detecta la BTK total. Además, el uso de un donante de fluorescencia común sirve para normalizar la detección de BTK total y libre con respecto a la otra.

El ensayo se caracteriza y se cuantifica usando la proteína BTK humana recombinante purificada de longitud completa y PBMC derivadas de voluntarios sanos y pacientes con LLC. Los autores demuestran la utilidad del ensayo utilizando células derivadas de muestras de pacientes con LCC y DLBCL. El equipo utilizó un ensayo multiplexado para la BTK libre y total que se procesa en placas de análisis de 384 pozos. Las placas procesadas se leyeron en un lector, basado en láser, EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

El ensayo de ocupación TR-FRET BTK se validó utilizando BTK recombinante humana purificada (rBTK) y extractos celulares. En base a un conjunto de seis estudios con muestras cuadruplicadas utilizando rBTK, el intervalo dinámico del ensayo fue de 9,75 a 312 ng/mL de BTK libre y total. Los límites inferior y superior de cuantificación fueron 12 ng/mL (límite de detección 6 ng/mL) y de 166 ng/mL, respectivamente. La variabilidad en los niveles de BTK libre y total dentro del rango dinámico completo del ensayo fue muy baja, con un coeficiente de variación (CV) interensayo ≤6% para la BTK libre y de ≤3% para la BTK total. Las PBMC en pacientes con tumores malignos de células B pueden mostrar niveles muy altos de BTK debido al enriquecimiento de las células B.

Los autores concluyeron que habían desarrollado, validado y calificado un ensayo dúplex homogéneo basado en TR-FRET para medir la ocupación de BTK en las PBMC obtenidas a partir de estudios clínicos de tirabrutinib. La utilidad del ensayo también se demostró usando células derivadas de muestras de ganglios linfáticos y médula ósea de pacientes con LCC y DLBCL. El estudio fue publicado el 6 de julio de 2018 en la revista SLAS DISCOVERY: Advancing Life Sciences R&D.