Desarrollan PCR en tiempo real para el diagnóstico del eumicetoma

Hay cuatro especies de Madurella que son fenotípicamente similares y causan un cuadro clínico invariable, pero difieren notablemente en su susceptibilidad a los medicamentos antimicóticos y el patrón epidemiológico. Por lo tanto, se requiere una identificación específica para el manejo óptimo de la infección por Madurella y para revelar la epidemiología adecuada de la especie.

Científicos de varios países que cooperaron con el Instituto de Biodiversidad Fúngica Westerdijk (Utrecht, Países Bajos), desarrollaron y estandarizaron una nueva reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex en tiempo real dirigida a las cuatro especies de Madurella. En total se incluyeron 47 cepas en este estudio, de las que 26 pertenecían al género Madurella, nueve a otros miembros de la familia Chaetomiaceae, nueve a especies de micometoma de grano negro en el orden Pleosporales, dos a Aspergillus y una especie a Rhizopus. Se obtuvieron 13 muestras clínicas de pacientes atendidos en el Centro de Investigación del Micetoma (Jartum, Sudán).

Las cepas se cultivaron en placas de agar con extracto de levadura de malta al 2% (MEA) o agar de glucosa Sabouraud (SGA), se incubaron durante dos semanas, se recogieron micelios y se extrajo el ADN. La pureza del ADN extraído se evaluó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA) y en geles de agarosa al 1%. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron utilizando un dispositivo de PCR rápida ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

La evaluación del ensayo utilizando cepas de referencia de las especies objetivo y no objetivo dio como resultado una especificidad del 100%, una alta reproducibilidad analítica y un límite de detección más bajo de 3 pg de ADN objetivo. La exactitud de la PCR en tiempo real se evaluó adicionalmente mediante biopsias de pacientes sospechosos de eumicetoma. A diferencia del cultivo y la secuenciación del ADN como métodos de diagnóstico estándar de oro, la PCR en tiempo real arrojó un diagnóstico exacto con identificación específica de la especie causal en tres horas en comparación con una o dos semanas requerido para el cultivo.

Los autores concluyeron que lograron desarrollar un análisis diagnóstico rápido y exacto que puede identificar simultáneamente M. fahalii, M. mycetomatis, M. pseudomycetomatis y M. tropicana. El ensayo se puede usar, tanto de manera dependiente como independiente de cultivo. El nuevo método reduce el tiempo de respuesta, así como la intensidad de la mano de obra y los altos costos asociados con los métodos actuales de referencia. El estudio fue publicado el 15 de enero de 2020 en la revista PLOS Neglected Tropical Diseases.

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Instituto de Biodiversidad Fúngica Westerdijk
Centro de Investigación del Micetoma
Thermo Fisher Scientific
Applied Biosystems