Estandarizada la citometría de flujo para predecir el rechazo a los trasplantes

La monitorización inmunológica mediante citometría de flujo de varios colores es una herramienta muy útil para evaluar la respuesta inmunitaria en el trasplante y tiene el potencial de arrojar una idea de los mecanismos responsables de un tratamiento exitoso. El trasplante de islotes es una terapia de vanguardia para la diabetes tipo 1 con un éxito notable en pacientes hipoglucémicos, donde las células beta pancreáticas de un donante se trasplantan a un receptor, permitiendo al cuerpo producir insulina y regular el azúcar en la sangre.

Científicos del Instituto Westmead para la Investigación Médica (Sídney, Australia) y sus asociados, reclutaron a ocho individuos sanos y 13 pacientes con diabetes tipo 1 (DT1), incluidos cuatro receptores de trasplantes de islotes inscritos en trasplantes de islotes y se recolectó sangre total periférica (STP).

El equipo utilizó 46 anticuerpos antihumanos conjugados con fluorocromo para los paneles finalizados. Todos los anticuerpos fueron suministrados por BD Biosciences (La Jolla, CA, EUA), excepto CD303 y CCR7 (CD197), que se obtuvieron de otros fabricantes. Se probaron 21 anticuerpos adicionales para ciertos antígenos de clones múltiples y/o fluorocromo.

Los 43 anticuerpos individuales se valoraron utilizando sangre total periférica anticoagulada de los individuos control sanos con 5-6 diluciones en serie de los anticuerpos. Las titulaciones de anticuerpos para CD137 (4-1BB) y CD154 se realizaron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que se estimularon con perlas CD3/CD28 activadoras de T (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) durante la noche a una dilución 1:10. El diseño del panel se basó en el brillo del fluorocromo, la densidad del antígeno y la coexpresión, el desbordamiento del fluorocromo de los subconjuntos de células inmunitarias de interésy la disponibilidad de reactivos en cada panel para los cinco parámetros BD-LSR Fortessa de BD Biosciences.

Se estandarizaron los procedimientos operativos, que incluyen la recolección de muestras, los cócteles de anticuerpos, el protocolo de coloración, la configuración del citómetro de flujo y el análisis de datos. Se calculó el índice de coloración de 43 anticuerpos y la matriz de propagación de desbordamiento para cada panel. Las concentraciones finales para los 46 anticuerpos utilizados se determinaron para la coloración de muestras de sangre total periférica. Se diseñaron y establecieron en el BD-LSRFortessa de cinco láseres el recuento de células absoluto y siete paneles de perfiles de leucocitos que consisten en subconjuntos y/o estados de granulocitos, monocitos, células dendríticas, B, NK y T, incluidas las células T reguladoras (Treg) y las NKT. Se estableció la capacidad para medir de forma reproducible los subconjuntos inmunitarios y los perfiles inmunitarios de los pacientes con trasplante de islotes hasta 18 meses después del trasplante como una herramienta para medir la reconstitución de las células inmunitarias después del trasplante.

Los autores concluyeron que estandarizaron los procedimientos operativos, la configuración del instrumento y el análisis de datos para el recuento absoluto de células inmunitarias y siete paneles multicolores de leucocitos utilizando 12 parámetros de un citómetro de flujo de cinco láseres. Los ajustes permiten una identificación clara de múltiples subconjuntos de leucocitos, incluso cuando están presentes en baja frecuencia en la sangre periférica. Demostraron la utilidad de los procedimientos para realizar evaluaciones longitudinales en pacientes con trasplante de islotes y tiene el potencial para monitorizar a los pacientes con trasplante y otros pacientes con inmunosupresión a largo plazo y para determinar si algún cambio en los subconjuntos de leucocitos se puede asociar con los resultados. El estudio fue publicado el 22 de mayo de 2019 en la revista PLOS ONE.

Enlace relacionado:
Instituto Westmead para la Investigación Médica
BD Biosciences
Thermos Fisher Scientific