Protocolo de PCR directo en tiempo real detecta virus de la viruela del mono

La pronta identificación de las personas infectadas, seguida del rastreo de contactos, es importante para detener la propagación de la enfermedad. La erupción característica de la viruela del mono progresa a través de múltiples etapas, comenzando con una fase macular, progresando a fases papulares, vesiculares y pustulosas, y terminando con una fase de costra.

Los patólogos clínicos de la Escuela de Medicina Feinberg (Chicago, IL, EUA) recolectaron especímenes clínicos de pacientes en ubicaciones dentro del sistema de salud de Northwestern Medicine. Las lesiones se frotaron con hisopos sintéticos estériles y los hisopos se enviaron al laboratorio secos o en 3 ml de medio de transporte viral (MTV M4). Los hisopos secos recibidos por el laboratorio se agregaron inmediatamente a 3 mL de MTV M4. Al comienzo del brote de viruela del mono, se seleccionaron secuencialmente un total de 20 muestras identificadas como positivas por el ensayo directo y 20 muestras identificadas como negativas por el ensayo directo para la confirmación por el método indirecto. La extracción de ADN para el método indirecto se realizó con el kit de extracción de ADN manual de Qiagen utilizando la purificación de ácido nucleico basada en columna giratoria (Qiagen, Germantown MD, EUA).

Se realizó una versión multiplex modificada del ensayo de viruela del mono de los CDC con fines de validación clínica. Se utilizaron sondas y cebadores publicados anteriormente dirigidos a la viruela del mono. Después del procesamiento, esto fue seguido por PCR en tiempo real en el instrumento Quant Studio 6 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Las condiciones de ciclo incluyeron un paso de activación de 20 segundos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 3 segundos a 95 °C y 30 segundos a 60 °C.

Los investigadores generaron una curva estándar diluyendo el ADN de control de la viruela del mono del plásmido a concentraciones que oscilaban entre 1 y 1.000.000 de copias/mL y determinando el valor de CT correspondiente. El ensayo mostró una excelente linealidad (R2 = 0,9994). El límite de detección se determinó mediante determinaciones repetidas de los valores de CT (n = 20) de muestras de 5, 50 y 1.000 copias/mL. Se determinó que los valores medios de CT de 5 copias/ml eran 36 tanto en el ensayo directo como en el indirecto, con una SD de 0,75 (rango, 34,61 a 37,39). La especificidad analítica se determinó ejecutando el ensayo con materiales de control para 23 virus, bacterias y hongos diferentes. El ensayo no detectó ninguna señal dentro del límite de detección en ninguno de los materiales de control. La sangre tuvo un efecto inhibidor en el ensayo, con una mayor concentración de sangre que condujo a una mayor inhibición. Las muestras con 20 % de sangre tuvieron una inhibición completa.

Los autores concluyeron que la validación de un ensayo de viruela del mono de método directo permitirá a los laboratorios reducir los costos, reducir la dependencia de la cadena de suministro para los kits de extracción de ácido nucleico y disminuir la exposición de los científicos de laboratorio a muestras potencialmente infecciosas. Además, puede ser adecuado para su incorporación en pruebas automatizadas y de alto rendimiento. Este método directo facilitará que los laboratorios de todo el mundo desarrollen, validen y escalen rápidamente las pruebas para el virus de la viruela del mono. El estudio se publicó en la edición de noviembre de 2022 de The Journal of Molecular Diagnostics.