Nuevo análisis de detección de patógenos empareja sondas de inversión molecular, secuenciación de última generación

La aplicación de sondas de inversión molecular (MIP) antes de la secuenciación mitiga varios de los problemas clásicos que rodean la NGS. Los problemas como el costo por muestra, los antecedentes del huésped y la necesidad de un conocimiento a priori para la PCR en tiempo real se mitigan mediante la amplificación múltiplex de MIP de varias firmas a la vez para incluir elementos de virulencia, genes de resistencia y otros elementos de identificación.

Los especialistas en enfermedades infecciosas del Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército (Fort Detrick, MD, EUA) diseñaron un panel de detección de patógenos que consta de 94 sondas dirigidas a 17 patógenos virales y un organismo parasitario, ocho sondas dirigidas a regiones variables del gen 16S rRNA para la clasificación taxonómica bacteriana , así como 71 sondas dirigidas a elementos de resistencia a antibióticos. Se analizaron y determinaron muestras de suero clínico humano de presuntas infecciones por el virus chikungunya (CHIKV) mediante RT-PCR en tiempo real.

El panel de identificación de patógenos (PIP) se diseñó utilizando el CLC Genomics Workbench (CLC Bio, Cambridge, MA, EUA) y AlleleID 7.73 (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EUA). Los científicos probaron la capacidad del secuenciador MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA) y el secuenciador MinIon (Oxford Nanopore Technologies [ONT], Oxford Science Park, Reino Unido) para secuenciar pequeños amplicones que se originan en este panel para la identificación de patógenos en matrices complejas.

Los investigadores informaron que la secuenciación de Illumina produjo más lecturas que la secuenciación de nanoporos; el número promedio de lecturas por muestra fue de aproximadamente 500.000 para Illumina y 50.000 para ONT. Sin embargo, al final, ambas plataformas tuvieron un rendimiento relativamente similar en cuanto a sensibilidad, especificidad y estadísticas generales. El equipo descubrió algunos matices entre las dos plataformas, específicamente en lo que respecta a la clasificación taxonómica 16S. De los 31 patógenos bacterianos identificados con el panel MIP y posteriormente secuenciados, el equipo descubrió que la secuenciación de Illumina logró una concordancia a nivel de género del 96,7 % en comparación con el 90,3 % con la secuenciación de nanoporos. Si bien ambas plataformas de secuenciación clasificaron erróneamente a Klebsiella oxytoca como Enterobacter, la secuenciación de nanoporos también clasificó erróneamente a Burkholderia cepecia y Enterobacter aerogenes.

Timothy Minogue, PhD, subdirector de la división de sistemas de diagnóstico de USAMRIID y autor principal del estudio, dijo: “La principal ventaja de usar MIP es la capacidad de multiplexación. En comparación con la PCR multiplex, que requiere diferentes conjuntos de cebadores para diferentes organismos objetivo, el enriquecimiento MIP utiliza cebadores universales para todas las amplificaciones, lo que elimina la competencia de la PCR”.

Los autores concluyeron que las MIP continúan siendo una valiosa técnica de amplificación molecular inicial que se adapta fácilmente a las tecnologías moleculares posteriores en constante evolución. Los aspectos moleculares fundamentales de las MIP, incluidas la especificidad y la adaptabilidad que ofrece la columna vertebral del enlazador, prometen que esta técnica molecular seguirá utilizándose en el futuro. El estudio fue publicado el 24 de enero de 2022 en The Journal of Molecular Diagnostics.