Análisis fluorimétrico cuantifica la actividad de la galactocerebrosidasa en muestras de sangre seca

La disminución de la actividad enzimática de la enzima galactocerebrosidasa (GALC) causa la enfermedad de Krabbe, un trastorno de almacenamiento lisosómico con consecuencias neurodegenerativas devastadoras. Se han descrito ensayos fluorométricos cuantitativos para la actividad de GALC en células aisladas de sangre y piel, pero no para muestras de manchas de sangre seca (DBS).

Un equipo de científicos, de la compañía comercial Baebies, Inc (Durham, NC, EUA) y de la Universidad de Duke (Durham, NC, EUA) desarrollaron un ensayo fluorimétrico, rápido, en placa de microtitulación para medir la actividad de la enzima GALC en muestras de DBS utilizando un nuevo sustrato: β-galactosa conjugada con un derivado fluorogénico de 6-hexadecanoil-4-metilumbeliferona con un grupo hidrófobo.

Las muestras se obtuvieron como sacabocados individuales (3,2 mm de diámetro) de tarjetas DBS de recién nacidos aparentemente normales. Se obtuvieron muestras archivadas, a las que se les quitó la identificación, de 10 pacientes afectados con la enfermedad de Krabbe de la Fundación Legado de Ángeles. Con el fin de extraer la enzima galactocerebrosidasa de las muestras de DBS, se colocó un sacabocados (3,2 mm) de cada DBS en pozos individuales de una placa de microtitulación transparente de fondo redondo y 96 pozos.

Se añadió solución de extracción de muestra (100 μL) a cada pozo de muestra; la placa se cubrió con un sellador adhesivo transparente para evitar la evaporación y luego se incubó en un agitador de placas (600 rpm) a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos. La actividad de la enzima se determinó agregando 10 μL de extracto de DBS a 10 μL de la solución de sustrato GALC, que se varió. La fluorescencia de la placa, medida como unidades de fluorescencia relativa (UFR), se leyó en un lector de placa de microtitulación, Synergy HTX (BioTek, Winooski, VT, EUA), con una longitud de onda de excitación de 400 ± 15 nm y filtros de emisiones de 485 ± 20 nm

El ensayo GALC fue optimizado cuidadosamente para garantizar un desempeño robusto de la pequeña cantidad de enzima presente en la muestra de DBS y para minimizar la interferencia de la β-galactosidasa. El equipo descubrió que el intervalo lineal del ensayo fluorimétrico GALC abarcaba todo el rango de muestras analizadas. La actividad en las presuntas muestras normales mostró un intervalo amplio (0,39 – 15,6 μmol/L/hora) con una media poblacional de 2,108 μmol/L/hora. Como se esperaba, la actividad de GALC en las muestras afectadas era significativamente menor que en las muestras presuntamente normales.

Los autores concluyeron que es factible un ensayo fluorimétrico para medir la actividad de la enzima GALC en muestras de manchas de sangre seca. Las mejoras en el ensayo, incluido el diseño novedoso del sustrato, el aumento de la concentración de sustrato y la eliminación de cloruro de sodio maximizan la especificidad del ensayo y minimizan la interferencia de la β-galactosidasa. El estudio fue publicado el 16 de octubre de 2019 en la revista Practical Laboratory Medicine.

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